蛋白酶含量檢測技術指南

蛋白酶含量檢測通常基于其催化水解特定蛋白質底物的能力，通過測定單位時間內水解產生的可檢測產物（如游離氨基酸或肽段）的量來定量酶活。常用且穩健的方法是 Folin-酚法（Lowry法改進） ，本指南以此為基礎詳述。

一、檢測原理

1. 酶促水解反應： 待測蛋白酶樣品在嚴格控制的溫度（通常37℃）和pH（依蛋白酶適pH設定，常用pH 7-8的磷酸鹽緩沖體系）條件下，與過量的特定蛋白質底物（常用酪蛋白）孵育固定時間。蛋白酶催化水解底物蛋白的肽鍵，釋放出含有酚羥基（如酪氨酸、色氨酸）的游離氨基酸和小肽段。
2. 顯色反應（Folin-酚法）： 酶反應終止后，加入堿性銅試劑（如雙縮脲試劑）。
   • 第一步（雙縮脲反應）： 蛋白質、多肽以及反應生成的肽段與堿性環境中的銅離子（Cu²?）絡合，形成紫色絡合物。
   • 第二步（Folin-酚反應）： 加入Folin-酚試劑（磷鉬鎢酸）。反應體系中游離的酪氨酸、色氨酸殘基（主要來自水解產物），以及第一步形成的銅-肽絡合物，共同將磷鉬鎢酸還原，生成藍色的鉬藍/鎢藍復合物（主要成分是Mo?O????和W?O????）。
3. 比色定量： 此藍色復合物在特定波長（通常為650nm或750nm）處有強烈吸收，其吸光度（OD值）與體系中游離酚羥基的含量（即蛋白酶水解產生的可溶性產物的量）成正比。通過與已知濃度的標準品（通常為L-酪氨酸）繪制的標準曲線比較，即可計算出樣品中蛋白酶水解產生的相當于酪氨酸的量，從而代表蛋白酶活性（含量）。

二、實驗步驟

• 試劑準備：
  • 緩沖液：選擇目標蛋白酶適pH的緩沖液（如磷酸鹽緩沖液），預熱至反應溫度。
  • 底物溶液：精確稱量酪蛋白溶解于預熱緩沖液中，必要時加熱助溶并冷卻至反應溫度，過濾去除不溶物。濃度應過量（通常0.5-2%）。
  • 三氯乙酸溶液：用于終止反應（常用10-15%，預冷）。
  • Folin-酚試劑工作液：按說明書配制或稀釋原液（通常現用現配或配制后短期避光冷藏）。
  • 堿性銅試劑：如雙縮脲試劑或改良Lowry試劑中的銅試劑。
  • L-酪氨酸標準溶液：精確配制系列濃度（如0-100 μg/mL）的標準溶液。
  • 待測蛋白酶樣品液：用緩沖液適當稀釋至預估活性范圍內（通常需要預實驗確定佳稀釋倍數）。
• 儀器準備：
  • 恒溫水浴槽（精確控溫±0.5℃）
  • 分光光度計及匹配比色皿
  • 計時器
  • 移液器（精確，定期校準）及相應吸頭
  • 離心機
  • 渦旋混合器
• 操作流程：
  1. 標準曲線制作：
     • 取一系列試管，分別加入不同體積的L-酪氨酸標準溶液（如0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL對應0-100μg），各管用蒸餾水補足至1.0 mL。
     • 每管加入5.0 mL堿性銅試劑，立即渦旋混勻。
     • 室溫靜置10分鐘。
     • 每管迅速加入0.5 mL Folin-酚試劑工作液，立即劇烈渦旋混勻。
     • 室溫避光靜置顯色30分鐘。
     • 在選定波長（650nm或750nm）下，以0號管（空白）調零，測定各標準管吸光度（OD）。
     • 以酪氨酸含量（μg）為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程（y = kx + b）及R²值（應≥0.99）。
  2. 樣品測定：
     • 酶促反應： 取兩支平行試管（A：樣品管； B：空白管）。
       • A管：加入1.0 mL預熱底物溶液 → 置于恒溫水浴中預熱5分鐘 → 精確加入1.0 mL預熱稀釋酶液 → 立即渦旋混勻 → 準確計時。
       • B管（空白）：加入1.0 mL預熱底物溶液 → 置于恒溫水浴中預熱5分鐘 → 加入1.0 mL預熱的稀釋酶液前，先加入2.0 mL預冷三氯乙酸溶液終止反應 → 再加入1.0 mL預熱稀釋酶液 → 渦旋混勻。
     • 孵育： A管在精確控溫（如37℃）的水浴中孵育精確設定的時間（如10分鐘）。時間選擇應使OD值在標準曲線線性范圍內。
     • 終止反應： A管孵育時間到后，立即加入2.0 mL預冷三氯乙酸溶液終止反應，充分渦旋混勻。
     • 沉淀去除： 將所有反應管（A管及其平行管、B管）靜置10分鐘，使未水解的蛋白質和酶變性沉淀。然后以適當轉速（如3000-4000 rpm）離心15-20分鐘。
  3. 顯色測定：
     • 小心吸取各管上清液2.0 mL（或根據預實驗確定的佳體積），分別轉移到另一組潔凈試管中。
     • 每管加入5.0 mL堿性銅試劑，立即渦旋混勻。
     • 室溫靜置10分鐘。
     • 每管迅速加入0.5 mL Folin-酚試劑工作液，立即劇烈渦旋混勻。
     • 室溫避光靜置顯色30分鐘。
     • 在與標準曲線相同的波長下，以B管（樣品空白）調零，測定各A管（樣品反應液）上清顯色液的OD值。
     • 注：每次測定都應包含標準曲線和樣品空白管。

三、結果分析

1. 計算水解產物酪氨酸當量： 將測得的樣品管OD值代入標準曲線的線性回歸方程（y = kx + b），計算出2.0 mL上清液中含有的相當于酪氨酸的量（μg），記為 C_sample。y 是OD值，x 是酪氨酸當量（μg）。
2. 計算蛋白酶活性單位（U）： 蛋白酶活性單位通常定義為：在規定的反應條件（溫度、pH）下，每分鐘催化水解底物產生相當于1微克（μg）酪氨酸的產物所需的酶量。
   • 活性 (U/mL) = [ (C_sample * V_total_supernatant / V_used_for_color) - C_blank ] / (V_enzyme * T) * D
     • C_sample：由標準曲線計算出的2.0 mL上清液中酪氨酸當量（μg）
     • V_total_supernatant：酶促反應終止并稀釋離心后上清液的總體積（mL）。通常是底物體積(1mL) + 酶液體積(1mL) + TCA體積(2mL) = 4mL。
     • V_used_for_color：用于顯色測定的上清液體積（mL），通常是2mL。
     • C_blank：樣品空白管測得的酪氨酸當量（μg）（通常很小，接近0，但需扣除）。
     • V_enzyme：酶促反應中加入的酶液體積（mL），通常是1mL。
     • T：酶促反應時間（分鐘）。
     • D：酶樣品的稀釋倍數（稀釋酶液體積倍數）。
     • (公式含義：計算每毫升原始酶液在每分鐘內產生的酪氨酸當量μg數)
3. 報告結果： 通常報告為蛋白酶活性單位（U/mL或U/g）。注明檢測條件（溫度、pH、底物、反應時間）。

四、常見問題解決方案

1. 顯色異常（顏色過深/過淺、顏色不正）：
   • 原因： 反應pH偏差；試劑失效（尤其Folin-酚試劑不穩定）；試劑加入順序錯誤；混勻不充分；顯色時間或溫度不一致；樣品或底物中含有干擾物質（如還原劑、高鹽、金屬離子）。
   • 對策： 嚴格按順序添加試劑（先加堿銅，后加Folin-酚），每次加入后立即充分混勻；確保緩沖液pH精確；確保Folin-酚試劑新鮮有效（避光冷藏，定期檢查空白值）；顯色過程保持時間、溫度一致；對復雜樣品（如發酵液），嘗試脫鹽、透析或有機溶劑沉淀等方法去除干擾物；設置樣品空白對照。
2. 標準曲線線性差（R² < 0.99）：
   • 原因： 酪氨酸標準品稱量或稀釋不準確；顯色操作不一致（時間、溫度、混勻度）；比色皿臟污或有劃痕；標準品部分降解。
   • 對策： 精確配制標準溶液；確保所有標準管操作同步且一致；徹底清洗比色皿；使用新鮮配制的標準品。
3. 重復性差（平行樣差異大）：
   • 原因： 酶促反應時間控制不精確（尤其是開始和終止）；移液操作誤差；孵育溫度不均勻；酶稀釋液混合不均勻或稀釋后不穩定；底物溶液不均勻。
   • 對策： 嚴格精確計時（使用秒表）；提高移液操作準確性和一致性（使用校準的移液器，排空吸頭）；確保水浴溫度均勻穩定（使用循環水浴或充分攪動）；酶液稀釋后充分混勻，并在冰上保持穩定；底物溶液充分溶解混勻（可短暫超聲或過濾）。
4. 樣品空白值過高：
   • 原因： 樣品本身含有大量游離氨基酸或小肽；樣品中含有能與Folin-酚試劑反應的還原性物質；終止反應不徹底，酶在空白管中仍有微弱水解。
   • 對策： 確保樣品空白管是在加入酶液前就加入了TCA終止反應；優化樣品稀釋倍數；考慮更換底物（如對特定樣品干擾大的底物）或采用其他檢測方法（如紫外分光光度法）；對樣品進行預處理（如透析脫鹽）。
5. 酶活性超出標準曲線范圍（OD值過高或過低）：
   • 原因： 酶樣品稀釋倍數不合適；反應時間過長或過短。
   • 對策： 通過預實驗確定樣品的佳稀釋倍數和佳反應時間。通常目標OD值應落在標準曲線中段（0.2-0.8）。

關鍵注意事項：

• 溫度控制： 酶活性對溫度極其敏感，務必確保水浴溫度精確、均勻。
• 時間控制： 酶促反應和顯色反應的時間必須精確。
• 試劑穩定性： Folin-酚試劑、堿性銅試劑和底物溶液需新鮮配制或按要求保存，定期檢查其有效性。
• 避免污染： 所有玻璃器皿需潔凈，避免引入干擾物。
• 操作一致性： 所有步驟，尤其是加樣、混勻、計時、顯色等，必須保持高度一致。
• 安全： 三氯乙酸和Folin-酚試劑具有腐蝕性，操作時需佩戴手套、防護眼鏡。

本指南提供了Folin-酚法檢測蛋白酶含量的詳細原理、步驟、分析和排障方案。實際應用中，需根據具體的蛋白酶特性（如適pH/溫度）和樣品基質進行必要的參數優化和驗證，以確保檢測結果的準確性和可靠性。